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質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)操作步驟

點(diǎn)擊次數(shù):18   發(fā)布時(shí)間:2024/10/15 11:15:42

1.基本原理 

將質(zhì)粒 DNA 導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)化( Transformation )。此感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞在 CaCl 2 低滲溶液中膨脹為球狀。質(zhì)粒 DNA 與 CaCl 2 形成抗 DNase 羥基 - 磷酸鈣復(fù)合物黏附于細(xì)菌表面,經(jīng) 42℃ 短時(shí)間熱沖擊處理,促進(jìn)細(xì)胞吸收 DNA 復(fù)合物。在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后,球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中,外源基因得到表達(dá)。在選擇性培養(yǎng)平板上,可選出所需的轉(zhuǎn)化子(即含有質(zhì)粒 DNA 的細(xì)菌)。鈣處理的感受態(tài)細(xì)胞,一般每微克 DNA 能獲得 10 5 ~ 10 6 個(gè)轉(zhuǎn)化子。除化學(xué)方法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外,還有電穿孔法( Electroporation ),其轉(zhuǎn)化率可高達(dá) 10 9 ~ 10 10 個(gè)轉(zhuǎn)化子 /μg 質(zhì)粒 DNA 。

 

2.器材 

①培養(yǎng)皿  ②恒溫培養(yǎng)箱

 

3.試劑 

① LB 培養(yǎng)基

②選擇性 LB 瓊脂培養(yǎng)平板(含氨芐青霉素,終濃度為 50μg/ml )

③氨芐青霉素 100 mg/ml

④宿主細(xì)菌:經(jīng) 100 mmol/L CaCl 2 處理的感受態(tài)細(xì)菌 DH5α

 

4.操作步驟 

①取 50 μL 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,加入適量質(zhì)粒(體積不得超過(guò) 4 μL )冰浴 30 min 后, 42℃ 熱激 90 s ,馬上放回冰上,冰浴 2 min ;

②加 400 μL LB 培養(yǎng)基,于 37℃ 搖床慢搖振蕩培養(yǎng) 45-60 min ;

③取 50-100 μL 涂在含有氨芐青霉素( 100 μg/mL )的 LB 固體培養(yǎng)基上, 37℃ 倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

 

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